细胞培养是生物科研的基本技能，但是很多刚进入实验室的新手，往往容易因为实验操作不当，导致细胞污染、状态变差等问题。本期我们主要从原理、操作、注意事项等几个方面介绍去全流程。
1细胞培养的基本类型
贴壁培养细胞：绝大多数细胞（如肿瘤细胞、成纤维细胞等）需要贴附在培养器皿表面生长，形成单层细胞；
悬浮培养细胞：细胞悬浮在培养基中生长，无需贴壁，如 Jurkat、K562 等免疫细胞。
2细胞培养的关键试剂与耗材
①培养基：不同的细胞使用不同的培养基，对于大部分肿瘤细胞来说多用DMEM培养基（一般配方为90%的合成培养基加10%的胎牛血清，根据需求加1%的双抗，防治细胞污染）。
不同的细胞使用的培养基不同，一般购买细胞的时候都会有细胞培养的说明书，如果是ATCC上购买的细胞，可以上官网查找，会有详细的介绍，包括细胞生长状态图、传代比例，培养基等。具体可见前期内容。别再盲目养细胞了！收藏这几个网址，细胞来源、培养条件一键查，新手也能少走弯路
②消化液：贴壁细胞最常用胰蛋白酶（0.25% 胰酶 + EDTA），适配 90% 以上的常规贴壁细胞（如 HeLa、293T、HepG2 等肿瘤细胞、普通成纤维细胞。我们应该根据细胞类型、贴壁强度、实验需求选择不同配方的胰酶消化液。使用胰蛋白酶（0.25% 胰酶 + EDTA）消化后需用含血清的培养基终止反应，防治消化过度导致细胞死亡。
③缓冲液：PBS（磷酸盐缓冲液）：无钙镁离子，用于洗涤细胞，在细胞传代的时候，用于去除培养基中的血清（防止抑制胰酶活性），以及去除细胞碎片等等。
④耗材：培养瓶 / 培养皿、移液管、离心管、冻存管都是一次性无菌耗材，在细胞培养操作的时候，全程注意无菌操作。
常见问题：
为什么培养基颜色多变?
培养基中会添加酚红指示剂，酚红指示剂会随着pH发生变化，其指示范围是6-8，当培养基偏酸的时候，培养基呈淡黄色，可是细胞代谢产生的乳酸等废物积累，需要及时更换新鲜培养基；检查细胞密度是否过高，必要时传代；也会因为培养箱的CO₂浓度的变化改变。
CO₂浓度不足（＜5%）：缓冲体系向产碱方向进行，pH 快速升高，培养基橘红→紫红→深紫；
CO₂浓度过高（＞5%）：缓冲体系向产酸方向进行，pH 轻微降低，培养基橘红→浅黄。
3细胞的居住环境细
胞培养的核心环境：模拟体内生理条件
核心条件：
温度：37℃（人体细胞）
CO₂浓度：5%，维持培养基的 pH 值；
湿度：95% 以上，能够防止培养瓶内培养基蒸发，培养箱内需定期加水，保持无菌水清洁。
问题②：细胞培养皿与细胞培养瓶的区别？
细胞培养皿和培养瓶是贴壁细胞培养最常用的两种耗材，二者材质一致。无菌要求相同，但是培养空间，方式有些许区别。
材质上主流是聚苯乙烯（PS），表面经亲水处理（带负电荷），保证贴壁细胞能顺利黏附生长，未亲水处理的耗材仅适用于悬浮细胞。
规格均以底面积（cm²） 标注核心规格，而非直径 / 容积，是选择耗材的关键依据（如 60mm 培养皿底面积≈21cm²，T25 培养瓶底面积 = 25cm²）
培养瓶为立式瓶身，配有透气或密封盖，常用规格有 T25、T75 等，培养时培养基用量少，气体交换可控，污染风险低，适合细胞的长期培养、日常保种和大量扩增；培养皿是平底敞口设计，分普通培养皿和 6 孔、96 孔等多孔培养皿，操作起来更方便，显微观察无视野偏差，细胞铺板的均匀性也更好，只是培养基容易蒸发，更适合开展短期实验、多组平行操作，以及需要显微观察、荧光染色的相关实验，实验室中二者搭配使用，可满足不同的细胞培养需求。
4细胞操作
细胞培养的核心围绕复苏→传代→换液→冻存展开，所有操作均在超净工作台内完成，严格按照无菌操作。
污染是细胞培养的最大敌人，所以全过程一定注意无菌操作：
1. 超净工作台使用前，开紫外灯照射 30min 灭菌，操作时开风机，关闭紫外灯；
2. 操作前用 75% 酒精擦拭双手、工作台面、所有耗材表面，避免用手直接接触耗材内部；
3. 移液、开盖等操作时，器皿口始终对着酒精灯火焰（保持 “火焰无菌区”），开盖后不要长时间暴露在空气中；
①细胞复苏：
1.从液氮罐中取出冻存管，装进一次性手套，放入 37℃恒温水浴锅，快速摇晃，1-2min 内完全解冻。
2. 将细胞转移至干净的15mL离心管，加入3mL培养基，轻轻吹打混匀，1000rpm离心5min
3.期间准备好培养瓶，标记好日期时间，姓名，细胞名称，代数，加入5-6mL培养基。
3. 离心好的细胞弃去上清，加入1mL培养基重悬后加入培养瓶，轻轻摇匀，放入 37℃、5% CO₂培养箱，静置培养 24-48h
②细胞传代：细胞传代详细步骤
③细胞铺板：原来细胞铺板这么简单
④细胞冻存：前期内容:冻存的时候细胞长得好好的，怎么一复苏？
常见问题③：为什么细胞冻存需要慢冻速溶
细胞冻存遵循慢冻速融原则，是为了最大程度减少低温对细胞造成的冰晶损伤，同时降低冻存保护剂（如 DMSO）的毒性影响，维持细胞的活性和结构完整，
慢冻：细胞内含有大量水分，如果直接快速冷冻，细胞内的水分会瞬间凝结成大体积冰晶，这些冰晶会物理性刺破细胞膜、损伤内质网、线粒体等细胞器，还会破坏细胞内的蛋白、核酸等生物大分子，导致细胞彻底失活；缓慢降温（常规速率约 - 1℃/min） 能让细胞内的水分通过细胞膜缓慢渗透到细胞外，在细胞外形成细小的冰晶，细胞内则因水分减少处于轻度脱水状态，既避免了细胞内大冰晶的形成，又能让冻存保护剂充分发挥作用，包裹细胞、减少细胞膜的低温损伤，最终让细胞进入休眠的冻存状态，保留活性。
速融：快速唤醒，降低冻存保护剂的毒性
冻存保护剂（如 DMSO）虽能保护细胞免受冰晶损伤，但对活细胞具有一定的毒性，且这种毒性会随低温下的接触时间延长而加剧。37℃水浴快速解冻（1-2min 内完全融化） 能让冻存液瞬间从固态变为液态，快速打破细胞的休眠状态，大幅缩短细胞与冻存保护剂的接触时间，降低其毒性影响。
常见问题④：如何判断细胞消化情况
判断细胞消化完成的核心是在镜下观察细胞形态和贴壁状态，在倒置显微镜下观察，贴壁细胞出现变圆、边缘翘起、少量脱落、细胞间间隙变大的特征，一般肉眼可见细胞层可以移动就可以终止。
常见问题⑤：细胞污染怎么办？
建议直接将污染的细胞扔掉，培养箱全面消毒；如果是非常珍贵的细胞，可以用含有抗生素的PBS反复清洗，消化后离心传代，并用含有抗生素浓度高的培养基培养，及时更换培养基看是否可以补救。